Mačji zarazni peritonitis jedna je od najtežih virusnih bolesti od kojih mačke obolijevaju diljem svijeta. Budući da je ova bolest uzrokovana promjenom crijevnog koronavirusa kod mačaka, veterinari i vlasnici kućnih ljubimaca u prošlosti nisu imali mnogo izbora liječenja. OtkrićeGS-441524 fip kao terapeutsko sredstvo promijenilo je područje mačje medicine, dajući pravu nadu tamo gdje prije nije bilo mnogo. Razumijevajući kako ovaj spoj zaustavlja replikaciju virusa, možete vidjeti zašto ima tako nevjerojatne učinke na bolesne mačke.
Ova tvar-za uništavanje virusa djeluje tako što sprječava umnožavanje koronavirusa u mačjim stanicama. Za razliku od većine lijekova koji se bave samo simptomima, GS-441524 fip hvata se u koštac s osnovnim strojevima za replikaciju virusa. Veliki porast u stopama preživljavanja uočenim u kliničkim uvjetima posljedica je ovog izravnog utjecaja na proliferaciju virusa. Vlasnici kućnih ljubimaca i veterinari postaju sve svjesniji ovog spoja kao važnog alata za liječenje onoga što se nekada smatralo fatalnom dijagnozom.
GS-441524 Fip
1. Opća specifikacija (na zalihama)
(1) Injekcija
20 mg, 6 ml; 30 mg, 8 ml; 40 mg, 10 ml
(2) Tablet
25/45/60/70 mg
(3) API (čisti prah)
(4) Stroj za prešanje tableta
https://www.achievechem.com/pill-press
2. Prilagodba:
Pregovarat ćemo pojedinačno, OEM/ODM, bez marke, samo za znanstveno istraživanje.
Interni kod: BM-1-001
GS-441524 CAS 1191237-69-0
Analiza: HPLC, LC-MS, HNMR
Tehnološka podrška: R&D Dept.-4
Nudimo GS-441524 fip, pogledajte sljedeću web stranicu za detaljne specifikacije i informacije o proizvodu.
Proizvod:https://www.bloomtechz.com/synthetic-chemical/api{3}}istraživanje-only/gs-441524-fip.html
Kako GS-441524 FIP zaustavlja replikaciju mačjeg koronavirusa?
Poseban enzim nazvan RNA{0}}ovisna RNA polimeraza pomaže koronavirusu koji uzrokuje infektivni peritonitis kod mačaka da kopira svoj genetski materijal. GS-441524 fip djeluje kao nukleozidni analog, što znači da je njegova molekularna struktura vrlo slična prirodnim građevnim blokovima koje virusi koriste za stvaranje novih RNA lanaca. Proces replikacije se usporava kada ovaj analog doda enzim virusne polimeraze umjesto pravog nukleozida.
Ovo pametno korištenje molekularnog oponašanja izvrstan je način za liječenje virusa, jer virus sam sebe zaustavlja u reprodukciji misleći da je lijek pravi dio.
Istraživači su pokazali da ovaj mehanizam radi vrlo dobro jer virusni enzim ne može razlikovati analogne i prirodne nukleozide. Jednom kada se analog doda rastućem lancu RNA, sprječava njegovo produljenje. Time se zaustavlja stvaranje virusnog genoma. Budući da je ova interakcija vrlo specifična, GS-441524 fip fokusira svoju aktivnost tamo gdje je najpotrebnija: unutar zahvaćenih stanica, gdje se virus kopira.
Ovaj spoj počinje djelovati kao lijek kada uđe u zaražene stanice pomoću nukleozidnih transportnih mehanizama. Endogeni enzimi mijenjaju molekulu u aktivni trifosfatni oblik unutar stanice. Ovaj proces aktivacije sličan je načinu na koji se nukleozidi prirodno razgrađuju u stanicama. To omogućuje spoju da radi s istim molekularnim putovima koje virus koristi za kopiranje samog sebe. Važno ga je promijeniti u trifosfatni oblik jer samo ovaj fosforilirani oblik može raditi s enzimom virusne polimeraze.
Studije pokazuju da ovaj spoj lako preuzimaju i koriste zaraženi monociti i makrofagi, koji su glavne mete za mutirani koronavirus. Količina postignute koncentracije unutar tih stanica dovoljno je visoka da zaustavi replikaciju virusa bez previše ozljeđivanja stanice domaćina. Ovaj koristan terapijski prozor je ono što objašnjava zašto mačke koje se liječe pravim dozama obično dobro podnose lijek i imaju veliki pad virusnog opterećenja.
Jedna od najboljih stvari kod ove antivirusne metode je ta što cilja samo na virusne enzime, a ne na enzime sisavaca. Koronavirusi imaju RNA-ovisnu RNA polimerazu koja se strukturno razlikuje od DNA i RNA polimeraza koje eukariotske stanice koriste za normalne metaboličke procese. GS-441524 fip iskorištava prednosti ovih razlika u strukturi, pokazujući da ga virusna polimeraza radije ugrađuje. Ova selektivnost smanjuje mogućnost ometanja važnih staničnih funkcija, što pridonosi dobrom sigurnosnom profilu spoja.
Korištena su biokemijska istraživanja kako bi se otkrilo kako analogna i virusna polimeraza međusobno djeluju na molekularnoj razini. Nadalje, ove studije pokazuju da su virusni enzimi puno bolji u vezivanju i inkorporiranju velikih količina od enzima domaćina. Ovo različito djelovanje daje razlog-temeljen na mehanizmu zašto terapeutske količine mogu zaustaviti replikaciju virusa bez utjecaja na mnoge stanice ili bez velikih negativnih učinaka na mačke koje se liječe.
GS-441524 Mehanizam prekida sinteze virusa FIP i RNA
Događaj prekida lanca događa se kada RNA-ovisna RNA polimeraza doda analog virusnom RNA lancu koji raste. StrukturaGS-441524 fipzaustavlja dodavanje više nukleotida, za razliku od prirodnih nukleozida, koji omogućuju daljnji rast molekule RNA. Ovo završava virusni proces, ostavljajući ga s nedovršenim, ne-radnim segmentima RNA koji ne mogu pomoći virusu da se sastavi ili zarazi nove stanice. Iznenadni prekid proizvodnje RNK vrlo je važna točka u životnom ciklusu virusa.
Koliko dobro funkcionira prekidanje lanca ovisi o tome koliko je aktiviranog spoja unutar stanice i koliko brzo se stvara virusna RNA. Klinički protokoli koji koriste redovito doziranje za održavanje stabilnih terapeutskih razina zaustavljaju replikaciju virusa na dulje vrijeme. Kada se mačke liječe prema poznatim standardima, njihovo virusno opterećenje obično brzo opada. To je popraćeno poboljšanjima njihovih kliničkih znakova, poput niže vrućice, boljeg apetita i nestanka izljeva.
Koronavirusi stvaraju dugu genomsku RNA i kraće subgenomske RNA, koje kodiraju različite virusne proteine. GS-441524 fip zaustavlja proizvodnju obje vrste RNA, što potpuno remeti program replikacije virusa. Genomska RNA djeluje kao nacrt za nove virusne čestice, a subgenomske RNA govore stanici kako napraviti strukturne i funkcionalne proteine. Kemikalija zaustavlja sintezu u tom rasponu, što znači da virus ne može pravilno izvršiti nijedan dio svog plana reprodukcije.
Ova -inhibicija širokog spektra tijekom životnog ciklusa virusa vrlo je korisna jer cilja patogen na nekoliko slabih točaka. Čak i ako neka sinteza virusne RNK prođe, spoj osigurava da nema dovoljno potpuno funkcionalnih virusnih dijelova koji se izgrađuju za stvaranje novih virusa koji su zarazni. Virus polako umire kod zaražene mačke zbog kumulativnog učinka. To omogućuje imunološkom sustavu da preuzme i ubije sve zaostale zaražene stanice.
Kada je prisutan antivirusni lijek, on smanjuje proizvodnju virusnih proteina istom brzinom kao i sinteza virusne RNA. Te je proteine, poput proteina šiljaka koji propušta stanice unutra i proteina nukleokapsida koji štiti RNK virusa, teško pronaći. Čak i mala količina virusne RNK koja se formira ne može se formirati u zarazne čestice ako nema dovoljno translacije proteina. Ukupni terapeutski učinak povećava se nedostatkom ovog proteina, koji na drugi način zaustavlja replikaciju.
Veterinari su primijetili da se, kako se mačke oporavljaju od svoje bolesti, upalni markeri postupno vraćaju u normalu. To je povezano sa smanjenjem prezentacije virusnih antigena. Budući da proizvodnja virusnih proteina opada, manje virusnih peptida može uzrokovati preaktivan imunološki sustav koji je tipičan za mačji infektivni peritonitis. Iako se događa nakon izravnog antivirusnog učinka, ova imunomodulacijska korist čini veliku razliku u kliničkom poboljšanju uočenom kod liječenih životinja.
Što blokira širenje virusa unutar stanica s GS-441524 FIP?
Spoj može dospjeti u stroj virusne replikacije na najosnovnijoj razini jer je njegova struktura slična adenozinu. U zaraženim stanicama, količina aktivnog analoga natječe se s prirodnim nukleozid trifosfatima da se pridruže rastućoj virusnoj RNK. Kada se zadrže terapijske razine, konkurentska dinamika daje prednost analogu, što dovodi do preferencijalne inkorporacije koja zaustavlja uobičajeno stvaranje virusne RNA. Ovo natjecanje između molekula jedan je od glavnih načina na koji virusna populacija unutar stanice ne može rasti.
Farmakokinetičke studije su pokazale da prava doza dovodi do razina unutar stanica koje su puno više od razine potrebne za zaustavljanje virusne polimeraze. Zbog ove prednosti koncentracije, većina pokušaja repliciranja virusa susrest će se s analogom, što će uzrokovati pojavu prekida lanca u velikom broju slučajeva. Molekularna blokada djeluje tako dobro da količina virusa u zahvaćenim tkivima značajno opada nekoliko dana od početka liječenja. Ovo je objektivan dokaz da je spoj antivirusan.
Da bi svaka čestica koronavirusa zarazila novu stanicu, potrebna joj je puna, točna kopija virusnog genoma. Preranim zaustavljanjem sinteze RNK,GS-441524 fipzaustavlja proizvodnju tih potpunih kopija genoma. Kada virusni genomi nisu puni, ne mogu reći stanici kako da napravi virusne proteine ili djelovati kao predlošci za više replikacije. Zbog ove fundamentalne promjene, stanice koje su već zaražene ne mogu stvarati više virusnih čestica. Time se infekcija zadržava na jednom mjestu i sprječava njeno širenje na druga tkiva.
Zaustavljanje proizvodnje genoma također utječe na to kako se virusi mijenjaju i razvijaju. Virus ne može stvoriti genetsku raznolikost koja bi mogla dovesti do otpornih mutacija ako se ne može pravilno replicirati. Ovaj dio procesa pomaže objasniti zašto se čini da se otpornost na spoj ne događa često u kliničkoj praksi. To je u suprotnosti s nekim antivirusnim lijekovima, gdje se otpornost pokazuje brzo jer se virus nastavlja kopirati dok je pod selektivnim pritiskom.
Suzbijanje unutarstanične replikacije putem GS-441524 FIP
U jednoj stanici, replikacija virusa obično se događa putem eksponencijalne amplifikacije, gdje svaki krug sinteze RNK stvara mnogo kopija koje se koriste kao početne točke za sljedeći krug. Ova metoda pojačavanja pomaže virusima da vrlo brzo naprave puno kopija. Antivirusni lijek zaustavlja proces sinteze pri svakom ponavljanju, što prekida te petlje pojačanja. Čak i ako prvi krug sinteze virusne RNA samo djelomično uspije, okolina ostaje ista za sljedeće krugove, što postupno smanjuje količinu virusne RNA u stanici.
Na temelju matematičkih modela o tome kako se virusi mijenjaju tijekom liječenja, ovo ponovljeno smanjenje trebalo bi brzo zbrisati virusnu populaciju. Ova predviđanja podupiru klinička opažanja koja pokazuju da mačke koje se liječe odmah nakon postavljanja dijagnoze često ozdrave tijekom prvog tjedna liječenja. Brz odgovor pokazuje da spoj može zaustaviti cikluse amplifikacije prije nego što izazovu nepovratno oštećenje tkiva. To pokazuje koliko je važno započeti liječenje što je prije moguće.
Najbolji način da se utvrdi djeluje li antivirusno sredstvo je po tome koliko se opasnih čestica oslobađa iz zahvaćenih stanica. GS-441524 fip omogućuje da se to dogodi tako što osigurava da se unutar tretiranih stanica formira vrlo malo, ako ih ima, cijelih čestica virusa. Virusna infekcija ne može se proširiti na zdrave stanice ili ostati živa u domaćinu bez stvaranja zaraznog potomstva. Ovaj učinak zadržavanja omogućuje imunološkom sustavu mačke da se polako riješi zaraženih stanica bez stalnog suočavanja s novim virusima.
Virološki testovi na uzorcima liječenih mačaka pokazuju da su razine infektivnih virusa puno niže nego u kontrolama koje nisu liječene. Ovi laboratorijski rezultati pružaju numeričku potporu kliničkim promjenama koje su vidjeli veterinari. Pronalaženje poveznice između nižih titara virusa i kliničkog oporavka doprinosi našem razumijevanju kako zaustavljanje unutarstanične replikacije izravno dovodi do terapeutske koristi.
Kemikalija neizravno sprječava nezaražene stanice da postanu nove mete zaustavljanjem rasta virusa u stanicama koje su već zaražene. Budući da u tkivima ima manje virusa, manja je vjerojatnost da će nezaražena stanica doći u kontakt s infektivnom česticom. Ovo zaštitno djelovanje je posebno važno jer sprječava infekcije da dođu do važnih organa poput mozga, bubrega i jetre.
Još jedna važna stvar koja pomaže da izgledi budu bolji s liječenjem je održavanje organa u radu zaustavljanjem više staničnih infekcija.
Histopatološke studije tkiva liječenih mačaka pokazuju manje novoinficiranih stanica nego u mačaka koje nisu liječene. Način na koji se virusni antigeni šire svemirom pokazuje da infekcije ostaju tamo gdje počnu i da se ne šire kroz tkiva tijekom vremena. Na primjer, ova opažanja na razini tkiva pokazuju kako zaustavljanje unutarstanične replikacije štiti organske sustave na pravi način, povezujući molekularne procese s kliničkim ishodima.
GS-441524 FIP i proces inhibicije životnog ciklusa virusa
Ciljanje na rane faze replikacije
+
-
Virusi ulaze u stanice, skidaju omotač, repliciraju se, sastavljaju i otpuštaju. Tijekom replikacije RNK,GS-441524 fipima najveći utjecaj. Rana intervencija može spriječiti daljnje napredovanje. Ako ne mogu duplicirati svoju DNK, virusi ne mogu proizvesti nove čestice niti zaraziti druge stanice. Ciljanje replikacije umjesto kasnijih faza može blokirati zarazni proces.
Kada terapija započne, životni ciklus virusa utječe na njezinu učinkovitost. Rano liječenje, prije nego što se infekcija proširi, često poboljšava zdravlje mačke. Inhibicijom reprodukcije virusa, lijek sprječava oštećenje tkiva, ali ga ne može popraviti. Rano otkrivanje i brzo liječenje povećavaju terapeutski uspjeh prekidanjem životnog ciklusa virusa uz održavanje funkcije organa.
Dugo-supresija virusa
+
-
Dugo-trajno antivirusno liječenje sprječava replikaciju virusa tjednima ili mjesecima. Ovo dugotrajno-zbrinjavanje važno je jer bi virus mogao ostati u staničnim rezervama nakon što se virusno opterećenje smanji. Dulji tretmani sprječavaju da zaostali virusi uzrokuju infekcije. Liječenje obično traje od 12 tjedana do nekoliko mjeseci, ovisno o težini bolesti i odgovoru pacijenta.
Praćenje mačaka nakon tretmana pokazuje da se razine virusne RNA stalno smanjuju i često se više ne mogu otkriti osjetljivim testovima. Klinički markeri, uključujući izljeve, proteine akutne faze i povećanje tjelesne težine, poboljšavaju se ovim smanjenjem virusne aktivnosti. Odnos između dugoročnog -smanjenja virusa i kliničkog poboljšanja podržava terapiju inhibicije životnog ciklusa.
Integracija s imunološkim čišćenjem
+
-
GS-441524 fip odmah blokira replikaciju virusa; infekcija se mora ukloniti. Kemikalija sprječava prebrzo razmnožavanje virusa za imunološki sustav. To omogućuje humoralnom i staničnom imunitetu da progresivno uništi zaražene stanice. Ova kombinacija lijekova koji blokiraju viruse i sposobnosti imunološkog sustava da ih eliminira savršena je za liječenje zaraznih bolesti: lijek potiskuje napadača dok ga imunološki sustav trajno eliminira.
Kako se količina virusa smanjuje, funkcija limfocita se poboljšava, a profili citokina vraćaju se na početnu vrijednost u liječenih mačaka. Kada se mačji infektivni peritonitis smiri, normalna imunološka kontrola može se uspostaviti. U pravilno liječenim slučajevima, terapijski odgovori traju dugo jer imunološki oporavak eliminira infekciju i sprječava njezin povratak.
Zaključak
Znanstveno čvrsta tehnika za liječenje bakterijskog peritonitisa kod mačaka je saGS-441524 fip, koji sprječava razvoj virusa. Ova kemikalija sprječava infekciju koronavirusom ciljanjem RNA-ovisne RNA polimeraze. Mehanizam prekidanja lanca i sposobnost ciljanja virusnih enzima umjesto enzima domaćina osiguravaju sigurno, učinkovito antivirusno djelovanje. Nedavni klinički dokazi pokazuju da mačke liječene ispravnim postupcima imaju stope preživljavanja koje su bile nezamislive prije ove mogućnosti terapije.
Poznavanje molekularne zamršenosti sprječavanja replikacije virusa pomaže veterinarima i vlasnicima kućnih ljubimaca da razumiju zašto strategije liječenja trebaju precizne rasporede doza i trajanje. Kemikalija se mora uzimati u stabilnim terapijskim dozama kako bi se zaustavili virusni ciklusi i spriječilo ponovno pojavljivanje. Ako se lijek isporučuje prema kriterijima-temeljenim na dokazima, mačke s terminalnim stanjem imaju nadu. Antivirusni-tretman zasnovan na mehanizmu zaustavlja viruse u ključnoj fazi, kao što pokazuje promjena prognoze.
FAQ
1. Zbog čega je GS-441524 fip učinkovit konkretno protiv mačjeg koronavirusa?
+
-
Spoj djeluje jer selektivno zaustavlja RNA-ovisan enzim RNA polimerazu koju koronavirusi trebaju sami kopirati. Ovaj virusni enzim strukturno se razlikuje od polimeraza sisavaca, što mu omogućuje učinkovitije ciljanje specifičnih stanica. Struktura nukleozidnog analoga spoja omogućuje mu uklapanje u puteve sinteze virusne RNK, a pritom ne smeta previše normalnim staničnim procesima. Budući da je selektivan, stvara dobar prozor liječenja u kojem se replikacija virusa može zaustaviti bez previše ozljeđivanja stanica domaćina.
2. Koliko dugo treba trajati supresija replikacije virusa za uspješno liječenje?
+
-
Kako bi liječenje djelovalo, rast virusa mora se zaustaviti najmanje 12 tjedana, iako je dulje vrijeme liječenja često bolje. Dulji vremenski rok je zato što virusne zalihe moraju biti potpuno iscrpljene kako bi obrambeni sustav mogao uništiti sve zaražene stanice. Ako dobijete samo kratkoročno-liječenje, virus se može vratiti nakon završetka liječenja jer još uvijek može ostati nešto virusa. Veterinarski savjet temeljen na tome kako svaki pacijent reagira pomaže u određivanju najboljeg trajanja liječenja za svaki slučaj.
3. Može li virus razviti otpornost na ovaj mehanizam inhibicije replikacije?
+
-
Postoje teoretski putevi za pojavu otpornosti, ali čini se da se stvarna otpornost ne događa često kada se pravilno slijede planovi liječenja. Spoj prati dio virusne polimeraze koji je vrlo stabilan i može podnijeti male promjene bez gubitka sposobnosti da djeluje kao enzim. Promjene koje bi virus mogle učiniti otpornim obično ga čine mnogo manje prikladnim, što čini manje vjerojatno da će otporne verzije preživjeti. Kada date pravu dozu, možete održavati visoke koncentracije unutar stanica. Ovo smanjuje selektivni pritisak koji bi mogao pogodovati mutantima koji su otporni. Manje je vjerojatno da će se otpor pojaviti kada ljudi slijede postavljena pravila.
Partner s pouzdanim GS-441524 FIP dobavljačem: BLOOM TECH
Veterinarski stručnjaci i farmaceutske organizacije traže pouzdaneGS-441524 fippartnerstva s dobavljačima otkrit će da BLOOM TECH nudi sveobuhvatne prednosti za nabavu ovog kritičnog antivirusnog spoja. Naši GMP-certificirani proizvodni pogoni koji se protežu na 100.000 četvornih metara ispunjavaju američke, EU, JP i CFDA regulatorne standarde, osiguravajući farmaceutsku-kvalitetu s dokumentiranom usklađenošću. Pružamo kompletnu analitičku dokumentaciju, uključujući podatke HPLC-a i masene spektrometrije, prateći regulatorne podneske i zahtjeve za osiguranjem kvalitete. S više od 12 godina stručnosti u organskoj sintezi i farmaceutskim intermedijerima, naš tehnički tim pruža dosljednu kvalitetu serije i skalabilnost od istraživačkih količina do masovne proizvodnje. Naš-model usluge na jednom mjestu uključuje regulatorne smjernice, stabilnost opskrbnog lanca i konkurentne strukture cijena dizajnirane za dugoročna-partnerstva. Osiguranje kvalitete prolazi trostruku provjeru putem tvorničkog testiranja, našeg QA/QC odjela i trećih-nadležnih agencija, uz potpuna jamstva povrata za sve-nesukladne proizvode.
Bilo da predstavljate farmaceutsku tvrtku kojoj je potrebna masovna nabava API-ja, istraživačku organizaciju kojoj su potrebni materijali-istraživačke kvalitete ili CDMO koji opslužuje klijente veterinarske medicine, BLOOM TECH pruža kvalitetu, pouzdanost i podršku bitnu za uspješne programe formulacije i distribucije GS-441524. Kontaktirajte naš tim naSales@bloomtechz.comkako bismo razgovarali o vašim specifičnim zahtjevima i otkrili kako naše integrirane mogućnosti mogu ojačati vaš lanac opskrbe ovim-terapijskim sredstvom za mačke koje spašava život.
Reference
1. Pedersen NC, Perron M, Bannasch M, Montgomery E, Murakami E, Liepnieks M, Liu H. Učinkovitost i sigurnost nukleozidnog analoga GS-441524 za liječenje mačaka s prirodno nastalim mačjim infektivnim peritonitisom. Journal of Feline Medicine and Surgery. 2019;21(4):271-281.
2. Murphy BG, Perron M, Murakami E, Bauer K, Park Y, Eckstrand C, Liepnieks M, Pedersen NC. Analog nukleozida GS-441524 snažno inhibira virus mačjeg zaraznog peritonitisa u kulturi tkiva i eksperimentalnim studijama infekcija mačaka. Veterinarska mikrobiologija. 2018;219:226-233.
3. Dickinson PJ, Bannasch M, Thomasy SM, Murthy VD, Vernau KM, Liepnieks M, Montgomery E, Knickelbein KE, Murphy B, Pedersen NC. Antivirusno liječenje primjenom analoga adenozin nukleozida GS-441524 u mačaka s klinički dijagnosticiranim neurološkim mačjim infektivnim peritonitisom. Journal of Veterinary Internal Medicine. 2020;34(4):1587-1593.
4. Jones S, Novicoff W, Nadeau J, Evans S. Nelicencirana antivirusna terapija slična GS-441524 može biti učinkovita za kućno liječenje infektivnog peritonitisa mačaka. Životinje. 2021;11(8):2257.
5. Krentz D, Zenger K, Alberer M, Felten S, Bergmann M, Dorsch R, Matiasek K, Kolberg L, Hofmann-Lehmann R, Meli ML, Straubinger RK, Hartmann K. Curing cats with feline infectious peritonitis with an oral multi-component drug containing GS-441524. Virusi. 2021;13(11):2228.
6. Addie D, Belák S, Boucraut-Baralon C, Egberink H, Frymus T, Gruffydd-Jones T, Hartmann K, Hosie MJ, Lloret A, Lutz H, Marsilio F, Pennisi MG, Radford AD, Thiry E, Truyen U, Horzinek MC. Infektivni peritonitis mačaka: ABCD smjernice za prevenciju i liječenje. Journal of Feline Medicine and Surgery. 2009;11(7):594-604.