L-tioglutaminska kiselinaje spoj prirodnog proizvoda koji se pretvara iz prekursora sličnih glukozinolatu u grannymonda povrću kao što je kelj, gorušica i brokula. Ima niz zdravstvenih učinaka, a naširoko se koristi za prevenciju kroničnih bolesti poput raka, kardiovaskularnih bolesti i dijabetesa. Rasprostranjen je u biljkama iz porodice krstašica, poput kelja, cvjetače i kupusa. Ima mnoga farmakološka djelovanja, poput antikancerogenog, protuupalnog, antioksidativnog, neuroprotektivnog, itd. Stoga je metoda sinteze L-tioglutaminske kiseline privukla veliku pozornost.
Trenutno se metode za sintezu L-tioglutaminske kiseline mogu podijeliti u dvije kategorije: biološka fermentacija i kemijska sinteza. Ove dvije metode su detaljno opisane u nastavku.
Metoda biološke fermentacije L-sulforafana:
Metoda biološke fermentacije je metoda sintetiziranja spojeva s mikroorganizmima. Probirom bakterijskih sojeva i optimizacijom uvjeta kulture, mikroorganizmi mogu proizvesti L-tioglutaminsku kiselinu tijekom procesa fermentacije. Sada je otkriveno da mnogi sojevi mogu sintetizirati L-tioglutaminsku kiselinu, kao što su Escherichia coli, Streptococcus thermophilus i tako dalje. Među njima je najčešća metoda sinteze L-tioglutaminske kiseline pomoću sojeva koje predstavlja Escherichia coli. Konkretni koraci su sljedeći:
1. Izolirajte sojeve koji proizvode L-tioglutamat, kao što je Escherichia coli, iz tla ili biljnog tkiva;
2. Usvojiti odgovarajući medij i uvjete uzgoja, kao što su temperatura, pH vrijednost, vrijeme uzgoja itd., za uzgoj Escherichie coli;
3. Prikupiti fermentacijski bujon bakterije Escherichia coli, izvršiti određenu obradu i pročišćavanje i dobiti L-tioglutaminsku kiselinu.
Metoda kemijske sinteze L-sulforafana:
Metoda kemijske sinteze je korištenje metode kemijske molekularne reakcije za sintezu L-tioglutaminske kiseline različitim sintetskim putevima. Trenutačno se metode kemijske sinteze uglavnom dijele na četiri tipa: metoda soli kolina, metoda sulfuril klorida, metoda redukcije karbonila i metoda agaroz sulfata.
1. Metoda kolinske soli:
Ova metoda je jedna od često korištenih sintetičkih metoda. Postupite na sljedeći način:
① Prvo, L-metionin i kolin reagiraju u kiselim uvjetima kako bi se stvorila rijetka dušikova zamjena za L-tioglutaminsku kiselinu.
② Zagrijavanje i hidroliza dušikovih supstituta u L-tioglutaminsku kiselinu u alkalnim uvjetima.
Prednost ove metode je što je reakcija jednostavna i laka za svladavanje, ali je iskorištenje malo.
2. Metoda sulfonil klorida:
Ova metoda koristi reakciju elektrofilne supstitucije za sintezu L-tioglutaminske kiseline. Postupite na sljedeći način:
① Reakcija L-metionina i sulfonil klorida u alkalnim uvjetima da se dobije sulfinat L-tioglutaminske kiseline.
② Sulfinat se hidrolizira u alkalnim uvjetima kako bi se stvorila L-tioglutaminska kiselina.
Prednost ove metode je u tome što je reakciju lako kontrolirati i što je iskorištenje visoko, ali treba koristiti otrovni sulfonil klorid.
3. Metoda redukcije karbonila:
Metoda se sastoji u korištenju reakcije redukcije za sintezu L-tioglutaminske kiseline. Postupite na sljedeći način:
①L-metionin reagira s acetoniminom stvarajući piridin pirimidin-2-en-4-on i pirimidin pirimidin-2-en-4-one-5-sulfat u isto vrijeme
②Pirimidin pirimidin-2-en-4-one-5-sulfat se reducira kako bi se dobila L-tioglutaminska kiselina.
4. Metoda agaroznog sulfata: Ova metoda je reakcija L-metionina i agaroznog sulfata u kiselim uvjetima kako bi se stvorila L-tioglutaminska kiselina. Zbog dobre katalitičke aktivnosti sulfata, učinkovitost i selektivnost reakcije su poboljšani. Viši, ali glomazniji za rukovanje.
U znanstvenim istraživanjima vrlo je važna detekcija L-sulforafana. Među njima je metoda agaroz sulfata jedna od klasičnih metoda detekcije. Metoda agaroznog sulfata i njezini koraci bit će detaljno opisani u nastavku.
Eksperimentalni princip
Metoda agaroza sulfata temelji se na stvaranju žutog kompleksa L-tiogalaktopikrina i barijevog sulfata, soli nastale u kiselim uvjetima, koristeći agarozu kao skelu za odvajanje L- Metoda sulforafana. Metoda se temelji na činjenici da u kiselim uvjetima žuti kompleks nastao reakcijom barijevog sulfata i L-sulforafana nije lako topljiv u vodi i taloži se u agarozi, kako bi se odvojio i detektirao L-sulforafan.
Eksperimentalni koraci:
Korak 1: Pripremite suspenziju agaroza-barijevog sulfata
Odvažite odgovarajuću količinu agaroze i barijevog sulfata, dodajte određenu količinu destilirane vode nakon miješanja i temeljito promiješajte, zagrijavajte dok se ne otopi ili ravnomjerno izmiješa, filtrirajte suspenziju filtrom s veličinom pora od 0.22 um i zatim kuhati 3 do 5 minuta. Kada se suspenzija ohladi ispod 50 stupnjeva, ali se još uvijek ne skrutne, ulijte otopinu u Petrijevu zdjelicu i stavite je na sobnu temperaturu dok se ne skrutne.
Korak 2: Priprema i obrada uzorka:
Izvažite uzorak ili standard za testiranje, dodajte dovoljno {{0}}.01 M otopine natrijevog pirofosfata da se otopi, dodajte odgovarajući volumen kloroforma za ekstrakciju, centrifugirajte 10-15 minuta , ukloniti tekućinu iz gornjeg sloja, ispariti kloroform da se prikupi ostatak, dodati 2 mL vode i 2 mL koncentrirane klorovodične kiseline, ponovno ekstrahirati s kloroformom, centrifugirati i gornji sloj je uzet. Uzeti 24 mL gornje tekućine, dodati 0,2 mL 2 postotne otopine bakrenog nitrata i 0,4 mL 5 postotne otopine olovnog nitrata, ekstrahirati jednom kloroformom, centrifugirati i uzeti gornju tekućinu koja se može koristiti kao eksperimentalni uzorak za ispitivanje.
Korak 3: Eksperiment ponovne analize:
Uzorci su dodani u suspenziju agaroza-barijevog sulfata i zagrijavani u vodenoj kupelji da se skrutne na 80 stupnjeva 2 sata. Nakon što se uzorak skrutne, suspenzija agaroza-barijevog sulfata se ohladi na sobnu temperaturu, a kompleks agaroza-barijev sulfat-uzorak se otopi pod puferskim uvjetima limunske kiseline i amonijeve soli. Na kraju, redom isperite vodom i vizualno provjerite boju kompleksa u agaroznoj sferi.
Korak 4: Analiza rezultata:
Izmjerite apsorbanciju filtrata nakon ponovne analize kako biste izradili standardnu krivulju, čime ćete dobiti sadržaj L-sulforafana.
Metoda agaroz sulfata je klasična metoda za odvajanje i detekciju L-sulforafana. Kroz niz koraka, L-sulforafan se može odvojiti i otkriti njegov sadržaj. Metoda ima prednosti jednostavnosti, visoke osjetljivosti i točnih rezultata, a obično se koristi u detekciji L-sulforafana u hrani, kozmetici i lijekovima.
Sažetak: Razvojem znanosti i tehnologije, metoda sinteze L-tioglutaminske kiseline kontinuirano se optimizira i unapređuje. Istodobno, metoda biološke fermentacije i metoda kemijske sinteze također imaju svoje prednosti i nedostatke, a koju metodu koristiti ovisi o stvarnoj situaciji.