GLP-1(veza:https://www.bloomtechz.com/Synthetic-Chemical/peptide/GLP-1-PEPTIDE-CAS-87805-34-3.html) je polipeptidni hormon koji se sastoji od 30 aminokiselina. S dubinskim istraživanjem GLP-1, razvijeno je sve više sintetskih metoda. Ovaj će članak sustavno predstaviti trenutno poznate metode sinteze GLP-1.
Metoda 1, sinteza čvrste faze:
Sinteza čvrste faze široko je korištena metoda za sintezu peptida i proteina, a često se koristi i za sintezu GLP-1. U sintezi čvrste faze, struktura jezgre nastaje povezivanjem prve aminokiseline sa smolom. Zatim se u nizu dodaje sljedeća aminokiselina i kemijski reagira s odgovarajućim kondenzacijskim sredstvom. Konačno, ciljni proizvod se može dobiti cijepanjem polipeptida od smole.
Važnost sinteze čvrste faze je u tome što omogućuje automatizaciju i proizvodnju velikih razmjera sinteze peptida. Trenutačne glavne metode sinteze čvrste faze uključuju Fmoc i Boc. Među njima, Fmoc metoda koristi N-Fmoc zaštitnu skupinu za zaštitu peptida, dok Boc metoda koristi tert-butiloksikarbonil za zaštitu karboksilne skupine.
Druga metoda, sinteza tekuće faze:
Sinteza u tekućoj fazi tradicionalna je metoda sinteze peptida u kojoj se reaktanti stavljaju u tekuću fazu za reakciju. Prednost sinteze u tekućoj fazi je u tome što su reakcijski uvjeti blagi i pogodni za modifikaciju osjetljivih kemijskih struktura. Međutim, zbog previše reaktanata, proces pročišćavanja je relativno težak. Kemijske reakcije u sintezi tekuće faze uključuju:
1. Reakcija kondenzacije:
Reakcija kondenzacije jedna je od najosnovnijih reakcija u sintezi peptida, odnosno karboksilna skupina koju pokreću kondenzacijski agensi kao što su DCC i HOBt povezuje se s amino skupinom aminokiseline reakcijom aciliranja. Uvjeti reakcije su blagi, a iskorištenje je visoko.
2. Reakcije eliminacije:
Reakcija eliminacije je redukcija metionina u ditiol pomoću NaBH4 i drugih redukcijskih sredstava, čineći ga neaktivnim. Reakcija se mora provesti u bazičnim uvjetima.
3. Uklanjanje zaštitnih skupina:
Zbog različitih funkcija aminokiselina u peptidnom lancu, za zaštitu će se koristiti različite zaštitne skupine. Nakon što je sinteza završena, potrebno je ukloniti zaštitnu skupinu. Za Fmoc metodu, piperidin se obično koristi za uklanjanje Fmoc; dok se za Boc metodu TFA koristi za uklanjanje Boc.
Metoda tri, kemijska sinteza:
GLP-1 je polipeptidni hormon s važnim biološkim aktivnostima. Njegova sinteza može se ostvariti različitim metodama, među kojima je kemijska sinteza jedna od najčešće korištenih metoda. Prednost kemijske sinteze je u tome što može proizvesti ciljane proizvode visoke čistoće, koji su prikladni za proizvodnju velikih razmjera. Metoda kemijske sinteze i detaljni koraci GLP-1 bit će predstavljeni u nastavku.
1. Sintetički put i odabir zaštitne skupine:
Molekula GLP-1 sastoji se od 36 aminokiselina, uključujući 21 L-tip i 15 D-tip aminokiselina. Prije izvođenja sinteze potrebno je odabrati odgovarajući sintetski put i odabrati odgovarajuću zaštitnu skupinu prema uvjetima sinteze. Fmoc sinteza čvrste faze obično se koristi za automatiziranu sintezu velikih razmjera. Ova metoda koristi N-9-fluorimido karboksilnu zaštitu (N-Fmoc) kao zaštitnu skupinu, a također treba odabrati odgovarajuću sekundarnu zaštitnu skupinu (kao što je tert-butil ili metil) kako bi se osigurala zaštita specifičnih mjesta. Svaki put kada se doda nova aminokiselina, Fmoc zaštitnu skupinu treba prvo ukloniti, a zatim dodati zaštićenu supstancu za spajanje sljedeće aminokiseline.
2. Sinteza slijeda jezgre aminokiselina:
Temeljna sekvenca GLP-1 sastoji se od 21 aminokiseline, uključujući ključnu serinsku i četiri dipeptidne sekvence prolil-glutaminske kiseline. U sintezi čvrste faze, sinteza slijeda jezgre može se podijeliti u sljedeće korake:
2.1. Dodajte karbamat octene kiseline (Fmoc-NH-CH2CO2Et) i 2-Cl-Trt-Cl u čvrstu sintetičku smolu i izvedite reakciju kondenzacije s DIC/NMM sredstvom za spajanje.
2.2. Uklonite Fmoc zaštitnu skupinu deprotekcijom reakcijske skupine.
2.3. Dodajte sljedeću aminokiselinu, ponovite korak 1 i korak 2 redom dok se ne sintetizira središnji slijed.
2.4. Stvaranje pentapeptidnih struktura na smoli čvrste faze. Dodajte reagens za acetalizaciju u smolu krute faze, reagirajte sa sredstvom za prepoznavanje N-terminala (kao što je HBTU), dodajte zaštitnu skupinu bočnog lanca serina kao pomoćnog redukcijskog sredstva, a zatim uklonite zaštitnu skupinu Fmoc.
2.5. Pod katalizom Bacillus subtilis transferaze (ProTide), pentapeptidna struktura prolazi reakciju izmjene s prekursorom serin jodoacetata.
3. Sinteza preostalog niza aminokiselina:
Nakon završetka sinteze jezgre sekvence, potrebno je nastaviti s dodavanjem preostalih aminokiselina, uključujući L- i D-tip aminokiselina. Dodavanje ovih aminokiselina mora započeti od jezgre sekvence, dodati sljedeću aminokiselinu u sekvenci i koristiti odgovarajuće sredstvo za kondenzaciju za izvođenje kemijskih reakcija dok se ne sintetizira potpuna GLP{2}} polipeptidna molekula. Tijekom ovog procesa, također je potrebno odabrati odgovarajuću zaštitnu skupinu prema potrebi i izvesti korake reakcije, uklanjanja zaštitne skupine i dodavanja aminokiseline u nizu.
4. Tretman natrijevim hidroksidom:
Nakon što su dodane sve aminokiseline, nepotpuno sintetizirani peptidni lanac formira se na smoli krute faze i treba ga obraditi da bi se formirala potpuno formirana peptidna molekula. Prvo, neformirani peptid treba hidrolizirati natrijevim hidroksidom, tako da se C-terminalna karboksilna skupina izvorno vezana za smolu odvoji od smole, a zaštitna skupina se odvoji u vodi. Nakon reakcije hidrolize dobiva se ciljni produkt.
5. Taloženje i pranje:
Nakon obrade, hidrolizirana otopina se tretira kiselinom kako bi se istaložio ciljni produkt. Zatim je talog resuspendiran u vodi, nakon čega je uslijedilo intenzivno pranje kako bi se uklonile nečistoće.
6. Pročišćavanje:
Posljednji korak je pročišćavanje željenog produkta, obično pomoću tekućinske kromatografije visoke učinkovitosti. Tijekom ovog procesa, čistoća proizvoda može se odrediti detekcijom vrha otopine u masenom spektru. Ukratko, kemijska sinteza GLP-1 zahtijeva više krugova složenih reakcija i strogih procesa pročišćavanja kako bi se konačno dobio aktivni ciljni proizvod.
Četvrta metoda, biosinteza:
GLP-1 je važan polipeptidni hormon s različitim fiziološkim učincima, uključujući poticanje lučenja inzulina, suzbijanje apetita, smanjenje tjelesne težine i održavanje osjetljivosti na inzulin itd. Metoda biosinteze GLP-1 uglavnom se sintetizira u L stanicama u žlijezdi gušterači, a brzina njegove sinteze regulirana je unosom hranom. Detaljni koraci predstavljeni su na sljedeći način:
1. Pripremni rad prije sinteze:
Prije biosinteze GLP-1 potrebno je obaviti neke pripremne radnje, uključujući određivanje vrste stanice koja se koristi, postavljanje uvjeta kulture i odabir odgovarajućeg katalitičkog enzima. L stanice su glavni izvor sinteze GLP-1 jer sadrže prekursore dva hormona, GIP (glukagonu sličan peptid 1) i GLP-1. L stanice se mogu izolirati iz crijevnog epitela kunića ili miša. Prije biosinteze potrebno je uzgojiti dovoljan broj stanica, osigurati dovoljno hranjivih tvari i odgovarajuće uvjete za uzgoj. Osim toga, potrebno je odabrati odgovarajući katalitički enzim za poticanje reakcije.
2. Sinteza i obrada prekursora:
Biosinteza GLP-1 uglavnom se odvija u L stanicama, a njegov prekursor se sastoji od dva hormona, GIP i GLP-1. Nakon ulaska u endokrine stanice, GIP i GLP-1 se obrađuju proteolitičkim enzimima i cijepaju na pojedinačne peptide. Niz enzima i kofaktora uključen je u ovaj proces, uključujući prekursorsku polipeptidnu acidazu (PC2), izomerazu i faktore kasne adhezije.
3. Međusobna konverzija između polipeptidnih segmenata:
Nakon obrade, GIP i GLP-1 peptidi se rekombiniraju u GLP-1 polipeptid. Ovaj proces zahtijeva upotrebu glukagonu sličnog peptida 1 (GLP-1) kao predloška na koji se drugi pojedinačni peptidi kombiniraju kako bi se formirali novi kompozitni polipeptidi. Ovaj proces također zahtijeva neke specifične enzime i čimbenike, uključujući prohormonsku konvertazu 1/3 (PC1/3) i karboksipeptidazu E (CPE).
4. GLP-1 lučenje:
Nakon što se GLP-1 sintetizira i preradi, pohranjuje se u citoplazmi i unutarnjim vezikulama endokrinih stanica. Kada su stimulirane prehranom, endokrine stanice oslobađaju GLP-1 i ulaze u krvotok kroz mikrožile. Ovaj proces je reguliran i kontroliran nizom putova prijenosa signala, uključujući cAMP-Ca2 plusi tako dalje.
Ukratko, biosinteza GLP-1 uključuje zajedničko djelovanje višestrukih veza i čimbenika. Kombinacija biosinteze i kemijske sinteze može pružiti bolju osnovu i podršku za istraživanje i proizvodnju GLP-1.
Peta metoda, enzimatska sinteza:
Enzimska sinteza je sinteza peptidnih lanaca katalizom bioloških enzima. U usporedbi s tradicionalnim metodama sinteze u tekućoj fazi, enzimatska sinteza može se provesti na sobnoj temperaturi, a može se odabrati širok raspon sirovina. Enzimi kao što su theta-liquid synthase, AEP, ACE, itd. obično se koriste za kataliziranje sinteze.
Zaključno, gore navedene metode su izvedive metode za GLP-1 sintezu. Različite metode prikladne su za različite eksperimentalne uvjete i okruženja farmaceutske proizvodnje.