Aprotinin CAS 9087-70-1

Aprotinin78R2S7, molekularna formula C284H432N84O, CAS 9087-70-1, To je inhibitor proteaze koji može inhibirati tripsin i kimotripsin, spriječiti aktivaciju drugih aktivnih proteasoma u gušterači i samoaktivaciju tripsinogena. Klinički se koristi za prevenciju i liječenje akutnog pankreatitisa, krvarenja uzrokovanog fibrinolizom i diseminirane intravaskularne koagulacije. Također se može koristiti za tretman protiv šoka. Inhibitori proteaze su tvari koje se mogu vezati na enzime i smanjiti brzinu razgradnje supstrata. Inhibitori proteaze s proteinskim svojstvima široko su prisutni, a iz soje su izolirane dvije vrste inhibitora proteaze s proteinskim svojstvima: Kuniz inhibitor tripsina i Baumann Bellck inhibitor. Prvi ima molekularnu težinu od 20-25 ku, dok drugi ima molekularnu težinu od 8 ku.

Rekombinantnaaprotinin(RTI16) može inhibirati kininazu i tripsin i prirodni je ne-specifični inhibitor serin proteaze. To je jednolančani bazični protein sastavljen od 58 aminokiselinskih ostataka, s 3 disulfidne veze unakrsno-povezane u lancu. Dugo vremena aprotin se koristi za liječenje akutnog pankreatitisa. Nakon 1990-ih rekombinantni aprotin počeo se koristiti u kardiotorakalnoj kirurgiji za zaštitu trombocita, smanjenje krvarenja i eksudacije te za kliničko liječenje bolesnika s poremećajima koagulacije. Stoga se tržišna veličina aprotina brzo proširila i postao jedan od važnih biokemijskih lijekova.

Sinteza

 

Trenutno su komercijalno dostupni pripravci rekombinantnog aprotina uglavnom ekstrakti iz organa kao što su goveđa pluća, koji imaju složene procese i visoke cijene. Stoga je od velike važnosti istražiti proizvodnju rekombinantnog aprotina metodama genetskog inženjeringa.

Kada se koristi ekspresijski sustav izlučivanja, proizvodnja aprotina općenito je niska, a aktivnost rezultirajućeg produkta također je niska. Kroz fuzijsku ekspresiju, očekuje se da će uvelike povećati razinu ekspresije rekombinantnog aprotina.

 

Rekombinantni plazmid za ekspresiju aprotina pGrxA BPTI konstruiran je u tu svrhu, a mjesto prepoznavanja za FXa je dizajnirano između fuzijskog partnera i rekombinantnog aprotina. Nakon ekspresije u obliku inkluzijskog tijela, fuzijski partner je pročišćen i ponovno smotan gel filtracijom. Fuzijski partner je izrezan pomoću FXa kako bi se dobio protein s istom aktivnošću kao prirodni proizvod. Kroz optimizaciju uvjeta ekspresije, prinos je značajno poboljšan u usporedbi s prethodnim sustavima ekspresije.

Optimizacija ekspresije inženjerskih bakterija:

 

Inokulirajte glicerolne bakterije iz cijevi na LB/AMP agar ploče, kulturirajte na 37 stupnjeva 20 sati, sastružite kolonije i inokulirajte ih u 5 mL LB/AMP tekućeg medija na 37 stupnjeva, 200 o/min i kulturite preko noći. Inokulirajte 5% inokuluma u 100 ml kukuruzne kaše, kulturirajte na 37 stupnjeva i 220 o/min na mućkalici, inducirajte 7 sati, a zatim centrifugirajte (8000 o/min, 5 min, 4 stupnja) da prikupite bakterijske stanice. Izvažite mokru težinu bakterijskih stanica i otkrijte njihovu ekspresiju pomoću 15% SDS-PAGE.

Uzgoj u spremniku za fermentaciju

 

Uzgoj u spremniku za fermentaciju:

Korištenje njemačkog rezervoara za fermentaciju Biostat od 30 L, na 37 stupnjeva, s otopljenim kisikom kontroliranim na 20%, pH 7,0. Upotrebom spremnika za fermentaciju za ekspresiju fuzijskog proteina, 260 g mokrih bakterijskih stanica je dobiveno iz 16 L fermentacijske smjese, približno 16 g/L; Razina ekspresije je oko 45%,

Razbijanje stijenke i dobivanje inkluzijskih tijela bakterijskih stanica:

 

Nakon završetka uzgoja, prikupiti bakterijske stanice, dodati 1 g bakterijskih stanica u 10 mL otopine A (50 mmol/L Tris HCl, pH 8,0, 1 mmol/L EDTA), temeljito ih suspendirati, sonicirati stanice u ledenoj kupelji, raditi 30 sekundi, interval od 10 sekundi, snaga 400 W, 30 ciklusa. Prenesite tekućinu u epruvetu za centrifugiranje, centrifugirajte na 4 stupnja i 8000 o/min 15 minuta, a talog je sirovo inkluzijsko tijelo.

Priprema otopine za otapanje inkluzijskih tijela:

 

Isperite sirovo inkluzijsko tijelo otopinom B (50 mmol/L Tris HCl, pH 8,0, 1 mmol/L EDTA, 1% Triton-X100) dva puta, svaki put 0,5 sati, centrifugirajte da biste uklonili supernatant i dobili relativno čista inkluzijska tijela. Dodajte 1 g inkluzijskih tjelešaca u 5 mL otopine C (50 mmol/L Tris HCl, pH 8,0, 8 mol/L uree, 1 mmol/L EDTA, 5 mmol/L DTT), inkubirajte preko noći na 4 stupnja, denaturirajte i otopite, centrifugirajte na 12000 o/min 15 minuta i sakupite supernatant da se dobije otapanje inkluzijskih tjelešaca rješenje. Dobiti rekombinantni aprotin.

Farmakološki učinci:

 

 

Aprotinininhibira ljudski tripsin, fibrinolitički enzim, angiotenzin u plazmi i tkivu putem reverzibilnih kompleksa inhibitora enzima formiranih u određenom kemijskom omjeru. Proteaze sa serinskom aktivnošću igraju glavnu ulogu u vazopresin kininogen kininskom sustavu, sustavu komplementa i koagulacijskom sustavu, gdje plazmin i vazopresin iz plazme imaju kritične uloge.

 

Aprotin ispoljava svoj inhibicijski učinak stvaranjem kompleksa aprotin proteaze preko aktivnog dijela serina na enzimu. Međutim, kada se kombinira s različitim proteazama, pokazuje različite konstante disocijacije. Vezanje s tripsinom je najjače (Ki=0.06nmoN), što je jedna od najnižih konstanti zabilježenih u interakcijama proteina-proteina (Laydunski et al. 1974). Vezanje s ljudskim fibrinolitičkim enzimom nije jako. Zbog visoke vrijednosti K kompleksa inhibitora enzima (Ki=1 nmoN), on može biti reverzibilan (Wimann, 1980.), a kompleks koji se veže na angiotenzin ljudske plazme prilično je slab (Ki=30 nmol/l), ali još uvijek unutar terapeutskog raspona aprotina (Nakahara, 1983.).

 

Aprotin se ne veže samo na slobodne enzimske molekule, već i na enzime koji su se već vezali na treću komponentu (ako aktivno središte enzima još ima sposobnost vezanja). Stoga aprotin inhibira slobodne fibrinolitičke enzime i može također inhibirati intermedijarni fibrinolizin lančani kinazni kompleks koji nastaje tijekom trombolitičke terapije lančanom kinazom (Wimann, 1980.).
Antifibrinolitički učinak aprotina temelji se na inhibiciji plazmina aktiviranog hidrolizom proteina. Za razliku od sintetskih antifibrinolitičkih otapala, zbog svoje izravne inhibicije prekomjerno aktiviranog plazmina, aprotin ne samo da štiti izravni supstrat (fibrin) od razgradnje plazminom, već također štiti fibrinogen, faktore V i VIII u plazmi i alfa 2-globulin u serumu.

 

U pokusima šoka izazvanog endotoksinom i hipovolemičnog šoka, Trasylol može značajno inhibirati aktivaciju kininogena. (Massion et al．1972).
Trasylol može spriječiti ili odgoditi razvoj plućnog intersticijalnog edema (šok pluća). Njegov inhibitorni učinak ovisi o dozi-i vremenu- (Lorthioir i sur., 1973.).
Tijekom šoka, ishemijska gušterača može proizvesti vrlo toksičnu peptidnu tvar, naime faktor inhibicije miokarda (MDF). Ovaj faktor je usko povezan sa smrću od šoka.

 

MDF se može otkriti u plazmi miševa, pasa, majmuna i ljudi s hemoragičnim, septičkim, kardiogenim šokom i šokom od opeklina. MDF može uzrokovati smanjenje kontraktilnosti miokarda u svim slučajevima krvarenja, a u isto vrijeme uzrokuje kontrakciju visceralnih otpornih žila, što dovodi do lokalne ishemije i proizvodnje više MDF-a. Štoviše, zbog toksičnog oštećenja retikuloendotelnog sustava, njegovo uklanjanje u krvotok je odgođeno. Trasylol može uvelike spriječiti proizvodnju MDF-a (Lefer 1984).

Aprotinin, kao spoj male molekule koji se odupire fibrinolizi, pokazuje značajna i specifična svojstva inhibicije enzima. Ne samo da učinkovito inhibira aktivnost tripsina, već također opsežno djeluje na druge srodne proteolitičke enzime, igrajući tako važnu ulogu u eksperimentima stanične biologije. Posebno tijekom lize i homogenizacije stanica i tkiva, Aprotinn može poslužiti kao učinkovit inhibitor proteaze, učinkovito sprječavajući slučajnu degradaciju ciljnih proteina, što je ključno za održavanje integriteta i točnosti uzorka.

Inhibicijski učinak Aprotinna pokazuje jasnu ovisnost o dozi, odnosno kako se njegova koncentracija povećava, tako se povećava i inhibitorni učinak na fibrinolitičku aktivnost. Ova značajka omogućuje istraživačima točniju kontrolu eksperimentalnih uvjeta kako bi dobili pouzdanije i ponovljive eksperimentalne rezultate. U međuvremenu, Aprotinn također može produžiti vrijeme zgrušavanja krvi, dodatno potvrđujući njegovu važnu ulogu u mehanizmu koagulacije. Pokusi in vitro pokazali su da je Aprotinn učinkovit endogeni inhibitor puta zgrušavanja koji može ometati i regulirati ključne procese u procesu zgrušavanja.

Aprotini je također pokazao svoje jedinstvene farmakološke učinke. Može značajno inhibirati proces otapanja krvnog ugruška in vitro, produljiti vrijeme krvarenja podrezivanja repa kod štakora i produžiti vrijeme koagulacije u ljudskoj plazmi. Ovi nalazi sugeriraju da bi Aprotinn mogao imati potencijalne učinke protiv krvarenja i tromboze. Kako bi dodatno potvrdili njegov učinak in vivo, istraživači su proveli pokuse na modelu arteriovenskog kratkog spoja štakora. Rezultati su pokazali da aprotnin može značajno smanjiti težinu krvnih ugrušaka, dodatno podupirući njegov potencijal kao antitrombotičkog lijeka.

Ukratko, aprotnin, kao spoj male molekule koji inhibira fibrinolizu, pokazao je značajna inhibicijska svojstva enzima i farmakološke učinke i in vitro i in vivo. Njegova primjena u eksperimentima stanične biologije daje istraživačima moćne alate, dok njegovi nalazi u studijama in vivo daju važne naznake i temelj za njegov razvoj kao lijeka protiv krvarenja i tromboze. U budućnosti, daljnjim istraživanjem mehanizma djelovanja Aprotnina i kliničkim ispitivanjima, očekuje se njegova šira primjena u medicini.

Popularni tagovi: aprotinin cas 9087-70-1, dobavljači, proizvođači, tvornica, veleprodaja, kupnja, cijena, rasuto, na prodaju