Streptavidin Sigma CAS 9013-20-1

1. Upoznajte streptavidin
Streptavidin (SA), izlučeni protein izveden iz Streptomyces avidinii, ima molekularnu težinu od približno 65-66 kDa i izoelektričnu točku od oko 6,0. To je tetramerni protein sastavljen od četiri homologne podjedinice, od kojih svaka ima neovisno vezno mjesto za biotin – što znači da se jedna molekula streptavidina može istovremeno vezati na četiri molekule biotina. Konstanta disocijacije (Kd) između njih je niska kao oko 10 ⁻¹5 M, što je jedna od najjačih poznatih nekovalentnih bioloških interakcija i može se smatrati najpreciznijim "mehanizmom molekularnog zaključavanja" u prirodi.

U usporedbi s avidinom dobivenim iz bjelanjka, ima neusporedive prednosti:

Ne sadrži modifikacije glikozilacije, općenito je električki neutralan, stoga ima izuzetno nisko ne-specifično vezanje u fiziološkim uvjetima, čistu eksperimentalnu pozadinu i odličan omjer signala-i-šuma. Osim toga, njegova izvrsna otpornost na denaturaciju i razgradnju proteazom, kao i njegova sposobnost da izdrži ekstremni pH, visoke temperature (70-80 stupnjeva C), organska otapala i konvencionalna sredstva za denaturaciju (kao što su SDS i urea), zamijenili su avidin i postali neosporni "zlatni standard" u sustavima vezanja biotina.

Upravo s ovim izvanrednim karakteristikama blista u poljima kao što su znanosti o životu, in vitro dijagnostika, pregled lijekova i biosenziranje.

2. Imunološko ispitivanje
Primjena u području imunološke detekcije je njegova najklasičnija i najraširenija primjena. Od svog razvoja kasnih 1970-ih, biotin streptavidin sustav (BAS) postao je kamen temeljac imunološkog označavanja i analize praćenja zbog svog ultra-visokog afiniteta i učinka kaskadnog pojačanja. Prema statistikama, oko 85% uobičajenih kemiluminiscencijskih analizatora koristi metode detekcije temeljene na BAS-u, što ukazuje na njihovu dominantnu poziciju.

2.1 Enzimski imunološki test (ELISA)

U ELISA-i, peroksidaza hrena (HRP) ili alkalna fosfataza (AP) mogu se spojiti i enzim se može precizno usmjeriti do cilja putem biotiniliranih protutijela. HRP katalizira TMB, DAB ili ECL luminescentne supstrate za proizvodnju snažnih kemijskih ili optičkih signala, dok AP katalizira BCIP/NBT, PNPP i druge supstrate za proizvodnju stabilnih boja ili kemiluminiscentnih signala. Biotinilirana ciljna molekula može se vezati na višestruko obilježeni streptavidin, postižući više{2}}amplifikaciju signala i omogućujući otkrivanje ciljeva niske zastupljenosti. Ova se tehnologija naširoko koristi u sendviču i kompetitivnoj ELISA-i, pokrivajući scenarije kao što su kvantifikacija proteina, otkrivanje protutijela, probir patogena itd.

2.2 Imunoblotiranje proteina (Western blot)
U Western Blotu, vezanje s biotiniliranim sekundarnim protutijelima može značajno povećati intenzitet signala ciljnih proteina na prijenosnim filmovima. U usporedbi s tradicionalnim sustavima sekundarnih protutijela, BAS sustavi mogu postići jače pojačanje signala zahvaljujući svojstvima četverovalentnog vezanja. Osim toga, zbog niskog ne-specifičnog vezanja streptavidina, pozadinska interferencija je značajno smanjena, što ih čini posebno prikladnima za kvantitativnu analizu proteina niske zastupljenosti.

2.3 Imunohistokemija (IHC) i imunocitokemija (ICC)
HRP označen ili AP označen streptavidin je preferirani alat za pojačanje signala za IHC i ICC. HRP sustav prikladan je za eksperimente koji zahtijevaju izuzetno visoku osjetljivost detekcije, dok je AP sustav posebno prikladan za sustave koji sadrže HRP inhibitore (kao što je natrijev azid) ili eksperimentalne scenarije koji zahtijevaju dugo-razvoj boje i stabilnost signala. Vezanjem biotiniliranih sondi ili protutijela na konjugate streptavidina, ciljne molekule mogu se točno locirati u dijelovima tkiva ili uzorcima stanica.

2.4 Imunofluorescencija (IF) i in situ hibridizacija (ISH)

Streptavidin označen fluoresceinom (kao što je FITC Streptavidin, PE Streptavidin, APC Streptavidin) univerzalni je alat za vizualizaciju za imunofluorescentno bojenje i in situ hibridizaciju. FITC marker ima valnu duljinu ekscitacije/emisije od približno 494/519 nm i pokazuje svijetlu zelenu fluorescenciju; Valna duljina ekscitacije/emisije PE markera je oko 565/578 nm, što je "zlatni standard" za više-kolornu protočnu citometrijsku analizu; APC marker pokriva daleki crveni spektar, olakšavajući više-slikanje u boji. Ovi fluorescentni markeri mogu se točno vezati na biotinilirana protutijela ili sonde nukleinske kiseline kako bi se postigla analiza lokalizacije i kvantitativna detekcija ciljnih molekula.

2.5 Protočna citometrija (FACS)

U protočnoj citometriji, fluorescentno obilježeni streptavidin (osobito PE obilježen) koristi se za otkrivanje antigena na površini stanice obilježenih biotiniliranim protutijelima. Njegova izvrsna svjetlina pruža iznimno visok omjer signala-i-šuma, koji može učinkovito otkriti stanične populacije s niskom površinskom ekspresijom antigena ili slabim signalima. Nezamjenjiv je reagens u analizi protočne citometrije u više boja.

2.6 Enzimski imunološki test (ELISPOT)
AP označen streptavidin pokazuje izvrsnu učinkovitost u ELISPOT-u i prikladan je za analizu čvrste -faze i sustave za bojenje tkiva/stanica. Može stabilno katalizirati proizvodnju supstrata prebrojivih točkastih signala za detekciju izlučivanja citokina na razini jedne-stanice.

3. Pročišćavanje proteina i nukleinskih kiselina
3.1 Afinitetna kromatografija i pročišćavanje proteina
Streptomicin je ključna komponenta pakiranja afinitetne kromatografije. Nakon označavanja biotinom proteina koji se pročišćava, on se miješa sa streptavidin agaroznim gelom (kao što je Streptavidin agaroza/sefaroza), a obilježeni protein će se tijesno vezati za streptavidin na punilu. Ispiranjem radi uklanjanja nečistoća, a zatim ispiranjem ciljnog proteina pod odgovarajućim uvjetima (kao što je ključanje SDS-PAGE pufera, tretman 0,1% SDS ili tretman 95% formamidom+10 mM EDTA pri pH 8,2), mogu se dobiti proizvodi visoke-čistoće.

Uzimajući industrijsku proizvodnju rekombinantnog humanog inzulina kao primjer, visoko{0}}kvalitetna magnetska zrnca streptavidina mogu vezati više od 1200 pmol slobodnog biotina po miligramu, a čistoća pročišćenog proteina može doseći preko 95%.

3.2 Imunoprecipitacija (IP) i imunoprecipitacija kromatina (ChIP)
Primjena magnetskih kuglica streptavidina u imunoprecipitaciji uvelike poboljšava eksperimentalnu učinkovitost. Istraživači mogu fiksirati biotinilirana antitijela na magnetska zrnca streptavidina i inkubirati ih zajedno sa staničnim lizatom.

Protutijela specifično hvataju ciljni protein i njegove proteine ​​u interakciji, tvoreći kompleks "ciljnog proteina antitijela magnetskih kuglica". Može se brzo odvojiti pod djelovanjem vanjskog magnetskog polja, uz jednostavan rad i visoku osjetljivost. U eksperimentima s ChIP-om, magnetske kuglice streptavidina također su korištene za hvatanje kompleksa proteina biotinilirane DNK i proučavanje interakcije između proteina i DNK.

3.3 Povlačenje eksperimenta
U proučavanju interakcija proteina-proteina, magnetska zrnca mogu uhvatiti biotinilirane proteine ​​mamaca i zatim "loviti" preproteine ​​koji s njima stupaju u interakciju. Na primjer, kada se proučavaju ključni signalni putovi u tumorskim stanicama, specifična antitijela koja prepoznaju protein P53 imobiliziraju se na magnetskim zrncima streptavidina i zajedno inkubiraju s lizatom tumorskih stanica kako bi se učinkovito obogatio P53 i njegovi povezani proteini. U usporedbi s tradicionalnim metodama imunoprecipitacije, IP s magnetskim zrncima ima veću osjetljivost i specifičnost te može učinkovitije obogatiti ciljne proteine ​​niske zastupljenosti.

3.4 RNA Pull-down
Magnetska zrnca također su prikladna za pokuse-spuštanja RNA. Nakon vezanja s magnetskim kuglicama streptavidina, biotinilirane RNA sonde mogu uhvatiti proteine ​​koji stupaju u interakciju s RNA iz staničnih lizata za proučavanje mreža interakcija RNA proteina.
3.5 Priprema jednolančane DNA i ekstrakcija nukleinske kiseline
Može se vezati s biotiniliranim oligonukleotidima za pripremu jednolančane DNA i učinkovitu ekstrakciju nukleinskih kiselina, igrajući važnu ulogu u molekularnom kloniranju i genetičkom inženjeringu.

4. Visoka propusnost detekcije i provjere lijekova
4.1. TR-FRET platforma za testiranje
Može se spojiti s luminescentnim kelatima kao što su europijevi kelati za izvođenje povezivanja signala i molekularnog hvatanja u sustavu otkrivanja TR-FRET (vremenski-razlučni fluorescentni rezonantni prijenos energije). Na primjer, THUNDER ™ streptavidin označen europijem posebno dizajniran za TR-FRET eksperimentalnu platformu može se stabilno vezati na različite biotinilirane modificirane molekule i naširoko se koristi u analizi interakcija proteina i preliminarnom pregledu ciljanih lijekova.

Ovaj je sustav homogen i ima visok-protok, što ga čini moćnim alatom za moderni razvoj lijekova.

4.2 Ciljana isporuka lijeka
Njegova svojstva vezanja biotina čine ga idealnim nosačem za sustave ciljane primjene lijekova. Spajanjem molekula lijeka s biotinom i korištenjem ciljane sposobnosti vezanja streptavidina može se postići precizna isporuka lijeka, poboljšavajući učinkovitost liječenja i smanjujući nuspojave.

4.3 Biosenzori i biočipovi

To je temeljni materijal za proizvodnju biosenzora i biočipova. Imobilizacijom streptavidina na površini čipa kao elementa za hvatanje, proteinske sonde ili antitijela označena biotinom mogu se imobilizirati na njemu, postižući visoku-propusnost i visoko-otkrivanje osjetljivosti. Na primjer, u ranom probiru proteinskih čipova za kardiovaskularne bolesti, magnetna zrnca streptavidina fiksiraju se na podlogu čipa i koriste za vezanje biotiniliranih proteinskih sondi. Ovo može točno otkriti abnormalnosti kod pacijenata u ranim fazama bolesti i kada su koncentracije markera u krvi niske kao cTnI od 0,01 ng/mL, pomaknuvši dijagnostički prozor za 2-3 sata u usporedbi s tradicionalnim dijagnostičkim metodama.

5. Stanična biologija i slikanje
5.1 Označavanje stanične površine i fluorescentno razvrstavanje stanica
Fluorescentno obilježeni streptavidin (kao što je Vari Fluor 488 Streptavidin) naširoko se koristi za označavanje stanične površine i fluorescentno razvrstavanje stanica. Njegov emisijski spektar pokriva cijeli vidljivi i bliski-infracrveni spektar svjetlosti, au više-eksperimentima označavanja bojama može lako ući u jezgru i citoplazmatsku strukturu, označiti ciljne proteine ​​za snimanje i analizu.

5.2 Nanotehnologija i samosklapanje materijala
Njegova svojstva četverovalentnog vezivanja čine ga idealnim "mostom" za samo{0}}sastavljanje nanomaterijala. Putem ciljanog vezanja biotin streptavidina mogu se konstruirati različite nanostrukture za interdisciplinarna istraživanja kao što su biološka snimanja i praćenje okoliša.

6. Protutijela protiv streptavidina
Sa širokom upotrebom streptavidinskog biotinskog sustava pojavio se problem koji se često zanemaruje - endogena anti-streptavidin antitijela (ASA) u uzorku mogu ometati sustav detekcije. Istraživanje je pokazalo da vezanje ASA na SA u reakcijskom sustavu može utjecati na ispravnu konstrukciju sustava specifičnih antigenskih protutijela, što dovodi do kompromitirane točnosti povezivanja, detekcije ili dijagnostičkih rezultata.

Kako bi se riješio ovaj izazov, pojavili su se setovi za otkrivanje anti-streptavidinskih protutijela, koji se mogu koristiti za otkrivanje endogene ASA u uzorcima pacijenata i izbjegavanje njezinog interferencije s BAS sustavom. Roche Custom Biotech je razvio neaktivni mutant streptavidina (Streptavidin rec. inactive, poly), koji se može dodati trenutnom sustavu bez dodatnih koraka za specifično blokiranje i uklanjanje smetnji ASA, poboljšavajući točnost i specifičnost sustava detekcije.

7. Interferencija biotina
Iako je streptavidinski biotinski sustav moćan, suočava se sa sve težim izazovom - interferencija biotina.

Kada postoji visoka koncentracija slobodnog biotina u ispitnom uzorku, on se natječe s biotiniliranim protutijelima za mjesto vezanja streptavidina, što rezultira iskrivljenim rezultatima detekcije.

Oralna primjena 100 mg biotina može dovesti do vršne koncentracije u plazmi od 375-450 ng/mL; Bolesnici s multiplom sklerozom mogu uzimati 300 mg/dan oralno, a njihove razine biotina u plazmi mogu premašiti 1000 ng/mL; Dnevni unos 500 mg biotina može dovesti do izrazito visokih koncentracija biotina u krvi. U sendvič imunotestovima, prekomjerna količina biotina može proizvesti pogrešno niske rezultate; U kompetitivnim imunotestovima može dovesti do pogrešnih visokih rezultata.

Brojne studije su pokazale da su TSH, tiroksin PTH, endokrini testovi kao što su adrenokortikotropni hormon, prolaktin, testosteron, kortizol, kao i tumorski markeri i srčani funkcionalni markeri, pod različitim stupnjevima utjecaja interferencije biotina. FDA je sukcesivno izdavala informacije upozorenja i odgovarajuće smjernice. Strategije suočavanja uključuju: serijsko razrjeđivanje uzoraka, prebacivanje na metode koje nisu BAS kao što je tekućinska kromatografija-masena spektrometrija, ponovno testiranje nakon čišćenja biotina (najkraće od 2 sata, čak 15 dana ili čak mjeseci) ili korištenje slobodnih čistača biotina.